kaiyun網(wǎng)頁登錄入口 開云在線是一位經(jīng)驗豐富的生物化學(xué)家，對RNA有著豐富的知識。她們一起成功地在試管中再造了細菌的基因剪刀，并簡化了剪刀的分子組成，使其更容易使用。兩個人因為發(fā)現(xiàn)年諾貝爾化學(xué)獎。其實還有一些生物學(xué)家對基因編輯技術(shù)做出了很多貢獻，例如華人科學(xué)家張鋒首次證明

　　之后大家繼續(xù)思考，既然crRNA可以引導(dǎo)Cas蛋白特異性識別靶序列，那CRISPR技術(shù)是否也可以應(yīng)用于核酸檢測中？答案是肯定的。隨著對CRISPR/Cas系統(tǒng)研究的不斷深入，Cas蛋白的特點及功能活性被逐漸認識并應(yīng)用，并且發(fā)現(xiàn)了更多的Cas蛋白，Cas12a、Cas13a等被定義并命名。表1中列出用于分子診斷的CRISPR/Cas系統(tǒng)及其特點。其中可以看到，Cas12a主要靶向單鏈或雙鏈DNA，而Cas13a可以直接靶向RNA。

　　2018年，Chen等研究發(fā)現(xiàn)當CRISPR/Cas12a蛋白以序列特異性的方式切割dsDNA時，會誘發(fā)強烈的、非特異性ssDNA的反式切割。作者利用Cas12a這一附屬切割活性開發(fā)了一種準確快速的檢測方法。該檢測方法將Cas12a與等溫擴增相結(jié)合，命名為DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)，并實現(xiàn)患者樣品中人瘤病毒(HPV)高靈敏檢測。

　　從樣本中提取HPV的DNA，通過重組聚合酶等溫擴增對DNA進行擴增，再將Cas12a-crRNA復(fù)合物和標記有熒光淬滅的單鏈DNA探針加入反應(yīng)體系。當Cas12a-crRNA復(fù)合物特異性結(jié)合并切割HPV的DNA時，激活Cas12a的非特異反式切割，即對單鏈DNA探針進行切割，ssDNA熒光基團在被切割后產(chǎn)生熒光信號并完成對樣本中HPV DNA的特異性檢測。DETECTR可以對樣本中HPV16和HPV18進行準確檢測，相關(guān)原理示意圖見圖2。對25個樣本進行DETECTR檢測結(jié)果與普通PCR檢測進行對比，結(jié)果完全符合。

　　2018年Gootenberg等對SHERLOCK技術(shù)進行升級，可以實現(xiàn)在單個反應(yīng)中檢測3 個ssRNA 靶標和1 個dsDNA靶標。研究人員對17 種CRISPR/Cas13a和/Cas13b酶進行了生化鑒定，選擇了3 種具有不同切割偏好的Cas13蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b 和CcaCas13b)與Cas12a和RPA結(jié)合使用，每一種擴增的核酸靶標與對應(yīng)的Cas-crRNA相結(jié)合，可激活對應(yīng)Cas蛋白的活性而切割其對應(yīng)的特異性底物，從而產(chǎn)生多種不同的熒光響應(yīng)，實現(xiàn)對不同靶標的檢測。相關(guān)原理見圖3-b。

　　但是根據(jù)上面的應(yīng)用可以看出，CRISPR/Cas技術(shù)通常需要與等溫擴增等技術(shù)一起使用才能完成檢測，需要RPA對目標靶標擴增后，CRISPR/Cas主要發(fā)揮的是特異性檢測的作用，是否可以不經(jīng)RPA等技術(shù)擴增而直接利用CRISPR技術(shù)進行核酸檢測呢？很多學(xué)者也在這方面進行了各種探索。

　　Hajian等在2019年開發(fā)一種CRISPR芯片，該芯片材質(zhì)基底為石墨烯，利用場效應(yīng)晶體管與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合來檢測是否有目標序列的存在。石墨烯芯片上預(yù)制許多CRISPR/dCas9分子復(fù)合物。其中dRNP復(fù)合體可以解旋雙螺旋DNA，并且掃描整條DNA鏈，如果發(fā)現(xiàn)目標序列，dRNP復(fù)合體就可以調(diào)控場效應(yīng)晶體管來輸出電信號完成檢測。但是整個芯片的檢測成本較高。相關(guān)示意圖見圖4.

　　2019年，Dai等通過探索Cas12a（cpf1）的反式剪切活性，想要開發(fā)一種通用的電化學(xué)傳感器。如圖5所示，Cas12a既有crRNA介導(dǎo)的特異性的順式剪切（cis-cleavage），也有非特異性的反式剪切活性（trans-cleavage）。圖5B中結(jié)合有亞甲基藍燃料的非特異的單鏈DNA分子被固定在金電極上。如果存在目標分子，Cas12a-crRNA就會介導(dǎo)對非特異ssDNA分子的反式剪切，產(chǎn)生較低的電化學(xué)信號；而如果沒有目標分子存在，Cas12a-crRNA不會激活其反式剪切活性，分子不會被切割，就會產(chǎn)生比較高的電化學(xué)信號，以此來判斷是否存在目標序列。

　　3）陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新的更有價值的Cas蛋白，可以更特異以及準確的進行分子檢測。

　　1）設(shè)計時在3’端需要合適的PAM序列，PAM序列使crRNA引導(dǎo)Cas蛋白正確識別靶序列的必要條件；

　　3）目前大部分都是與RPA等擴增技術(shù)聯(lián)合使用，但是擴增也可能會引入誤差，同時也有污染的風險。

　　CRISPR/Cas技術(shù)在核酸檢測中發(fā)揮了重要作用，為核酸檢測提供了新的思路。未來的研發(fā)方向主要是更加流程化，減少中間的操作步驟，使得檢測更加快速和便捷。隨著基于CRISPR/Cas技術(shù)的核酸檢測平臺的不斷發(fā)展，未來在分子診斷方面將發(fā)揮更重要的作用。