1、 CRISPR技術(shù)的簡介及應(yīng)用 章建瀛 王清水 鐘雯婷 林幼玉【Summary】基因組編輯技術(shù)是幫助治療方法最具挑戰(zhàn)性但最有效的工具之一。Crispr可以提高基因編輯的效率，并盡量減少脫靶率。定期排列的短回文重復(fù)序列（CRISPR）相關(guān)蛋白（Cas9）是一種革命性的基因組編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9在多種疾病中的新應(yīng)用已經(jīng)證明了它的有效性，并已應(yīng)用于體外體細(xì)胞和多能干細(xì)胞的模型，以及體內(nèi)動物模型，最終可能被用來糾正有缺陷的基因。本綜述的重點(diǎn)是CRISPR/Cas9的最近應(yīng)用及其對治療具有挑戰(zhàn)性的人類疾病的貢獻(xiàn)，例如各種類型的癌癥、神經(jīng)退行性疾病和廣泛的其他疾病。CRISPR技術(shù)是一種新的疾病治療方法，提高了藥物的有效性，促進(jìn)了個(gè)性化醫(yī)學(xué)的發(fā)展?！綤ey】CRISPR，Cas9，基因編輯，基因治療，人類疾病R-3 A 2026-5328（2021）08-104-03English abstract：Genome editing techniques are considered to be one of the most challenging yet efficient tools

　　4、也可以指導(dǎo)Cas進(jìn)行切割2。通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進(jìn)行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合后的RNA具有與crRNA：tracrRNA復(fù)合體類似的活力，但因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達(dá)sgRNA的原件與表達(dá)Cas9的原件相連接，得到可以同時(shí)表達(dá)兩者的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，便能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行操作。質(zhì)粒等載體通過tracrRNA：crRNA介導(dǎo)Cas9切割的位點(diǎn)是有特異性的，即PAM序列上游的三個(gè)堿基對處。PAM僅有幾個(gè)堿基構(gòu)成（通常為NGG），它可以根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的類型定位并精確排序2。PAM 序列是Cas9識別靶DNA的重要影響因素。目前研究表明，II型CRISPR特異性靶位點(diǎn)必須完美結(jié)合PAM序列和在gRNA3末端的seed sequence 8-12個(gè)堿基1。由于編輯基因效率高、設(shè)計(jì)操作簡單與在多種細(xì)胞中通用性好等優(yōu)勢，CRISPR-Cas9 的基因組編輯技術(shù)成為ZFNs 與TALENs 之后的新一代基因組編輯技術(shù)。為了測CRISPR-Cas9系統(tǒng)HR（同源重組）的效率，研究者設(shè)計(jì)兩種gR

　　5、NA（T1和T2）作用于AAVS1片段，并且與之前了解到的TALEN技術(shù)進(jìn)行活性比較。圖中，通過流式細(xì)胞技術(shù)明顯可以看出donor+ hCas9+T1 gRNA組、donor+hCas9+T2gRNA組比donor+AAV51 TALENs組的同源重組率要高得多1。ZFNs技術(shù)和TALENs都是之前已知已應(yīng)用于基因組編輯人工核酸內(nèi)切酶的方法，這兩種方法只能在DNA的單鏈形成缺口，有一定的技術(shù)局限，而且成本較高，而CRISPR/Cas9酶可以在可以在DNA雙鏈上形成缺口，操作比較簡單并且效果顯著。CRISPR的II型系統(tǒng)內(nèi)，為了識別并在目標(biāo)DNA上形成雙鏈切口，有幾個(gè)結(jié)構(gòu)是很重要的，一是crRNA與tracrRNA這兩種RNA組成的dual-RNA結(jié)構(gòu)或類似結(jié)構(gòu)（sgRNA），二是Cas9內(nèi)切酶，三是特定的位點(diǎn)即PAM序列。編輯好的Cas9內(nèi)切酶與設(shè)計(jì)成一個(gè)單一轉(zhuǎn)錄因子的gRNA相互配合，可以標(biāo)記并切割DNA序列。CRISPR-Cas9為基因靶標(biāo)和基因編輯應(yīng)用提供了更多可能性2。CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用一、在人類細(xì)胞基因水平上CRISPR-Cas9基因敲出、篩選。通過編輯CRIS

　　6、PR關(guān)聯(lián)的內(nèi)切酶Cas9去修改特定的基因底座是一種新方法，這種方法可以更簡單地了解基因的在全基因組水平上的功能?；蛩缴螩RISPR-Cas9 基因敲除庫已經(jīng)標(biāo)記了18080個(gè)基因和64751個(gè)獨(dú)特的引導(dǎo)序列可以用于在人類細(xì)胞中的陰性篩選和陽性篩選。首先，在癌細(xì)胞和多能干細(xì)胞中使用GeCKO（genome-scale CRISPR-Cas9 knockout）庫識別細(xì)胞存活必要基因，接著，在黑色素瘤模型中篩選缺失vemurafenib抑制劑的基因。研究者研究得到的最好的候選基因有NF1、MED12、NF2、CUL3、TADA2B和 TADA1。通過一系列實(shí)驗(yàn)，不同的gRNA靶向相同的基因有很高的命中率，確定Cas9基因篩選前景的光明4。GeCKO篩選是一個(gè)系統(tǒng)而獨(dú)特的方法，用RNA抑制劑干擾基因的功能。RNA抑制劑會減少目標(biāo)RNA蛋白的表達(dá)量，而GeCKO可以引導(dǎo)功能缺失的突變體進(jìn)入DNA。RNA抑制劑可以限制轉(zhuǎn)錄，而Cas9：sgRNAs可以識別基因組內(nèi)的很多因子，比如啟動子：增強(qiáng)子、內(nèi)含子和基因間隔區(qū)。此外，催化Cas9不活躍的突變體可以根據(jù)不同功能域被分類，進(jìn)而擴(kuò)大其干擾方式，

　　7、包括基因組功能篩選的應(yīng)用、Cas9的激活和表觀遺傳修飾。運(yùn)用不同sgRNA有效進(jìn)行完全基因敲除有著高度一致性，因此通過Cas9：sgRNA技術(shù)改變基因組的功能是可行的4。二、用CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯多種基因選擇性干擾個(gè)別基因原件造成的基因突變需要精準(zhǔn)有效地基因識別技術(shù)，雖然之前已經(jīng)有ZFs、TALEs等技術(shù)可以以DNA為靶標(biāo)，但是不夠有廣泛性而且成本較高。因此研究者設(shè)計(jì)了新的基因編輯工具，這個(gè)工具是基于II型原核生物的CRISPR獲得性免疫系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶制作而來的。II型原核CRISPR的獲得性免疫系統(tǒng)已被證明能促進(jìn)RNA指導(dǎo)的特殊位點(diǎn)DNA切割。研究者設(shè)計(jì)了兩種不同的II型CRISPR系統(tǒng)，并且證明了可以用短序列RNA指導(dǎo)Cas9核酸精準(zhǔn)切割在人類以及小鼠細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源基因座。Cas9也可以修飾成切口酶，用最小的致突變活性促進(jìn)同源定向修復(fù)5。研究者在哺乳動物細(xì)胞編碼SpCas9和RNaseIII并附上核苷酸定位因子以便區(qū)分。這些結(jié)構(gòu)在人類的293FT細(xì)胞中表達(dá)，說明兩種核酸定位因子識別SpCas9很有效果。通過重組、熒光表達(dá)、電泳、測序等步驟后發(fā)現(xiàn)，RNase I

　　8、II 在protospacer（原型間隔序列）的切割過程中是不需要的，并且當(dāng)RNase III 不存在的時(shí)候，89-nt tracrRNA可以被加工。同樣pre-crRNA的成熟也不需要RNase III，這證明可能有內(nèi)源性RNases可以幫助crRNA前體成熟。去除任何剩余的RNA或Cas9原件會使CRISPR系統(tǒng)的基因組切割活性丟失。因此這些結(jié)果證明CRISPR有效介導(dǎo)基因修飾需要三個(gè)原件系統(tǒng)。接著研究者以EMX1基因座的原始間隔序列為靶標(biāo)，探究真核細(xì)胞中CRISPR介導(dǎo)的切割效果是否具有普遍性，證明他們設(shè)計(jì)的驅(qū)動pre-crRNA和SpCas9表達(dá)載體可行性5。S. Pyogenes CRISPR系統(tǒng)可以在哺乳動物細(xì)胞中的異源重組進(jìn)行方便高效的基因組編輯，并證實(shí)CRISPR介導(dǎo)的基因靶標(biāo)多種人類細(xì)胞是十分高效的。在S. Pyogenes CRISPR系統(tǒng)NGG序列的需求限制了靶標(biāo)間隔（8bp），但探索Cas9家族和不同PAM的需求可以打破這些限制。事實(shí)上，其他CRISPR位點(diǎn)很可能被移植到哺乳動物細(xì)胞中，比如嗜熱鏈球菌 LMD-9 CRISPR1也可以介導(dǎo)哺乳動物基因組切割5。三

　　9、、CRISPR/Cas系統(tǒng)與HIV通過高效的抗逆轉(zhuǎn)病毒可以控制HIV-1病毒的復(fù)制，這時(shí)候HIV-1病毒處于休眠狀態(tài)，稱之為潛在的前病毒，但它可能在任何時(shí)候?qū)θ梭w再次構(gòu)成威脅。但是，以擾亂HIV-1病毒前體為目標(biāo)的新技術(shù)可能從染上病毒的個(gè)體根除病毒基因組。LTR-targeting CRISPR/Cas9組件轉(zhuǎn)染HIV病毒休眠表達(dá)處或者已經(jīng)誘導(dǎo)的T 細(xì)胞中，刺激后LTR引起有意缺失表達(dá)，從而導(dǎo)致HIV無法致病。通過序列分析證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效切割靶位點(diǎn)，并引起LTR靶位點(diǎn)突變。研究者成功擾亂HIV-1病毒前體的表達(dá)，Cas9蛋白有著RuvC和HNH兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，擁有自主的ssDNA切割活性，而突變體缺失RuvC和HNH其中一部分就會變成內(nèi)切酶。為了抑制HIV-1 前病毒表達(dá)，TAR位點(diǎn)是最理想的靶基因。CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶標(biāo)專一性很強(qiáng)，靶基因的1 個(gè)堿基發(fā)生突變都有可能導(dǎo)致干擾識別，這意味著一些病毒前體可能從這個(gè)基因編輯結(jié)構(gòu)中逃脫。而TAR位點(diǎn)相對比較保守，而且在不同的HIV 病毒亞類中也基本一致。通過研究，作者等人發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯HIV-1基因組可以抑制其表達(dá)的潛能性6。Kaiyun官網(wǎng)登錄入口 開云網(wǎng)站四、通過CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯一步設(shè)計(jì)帶有報(bào)道因子的小鼠研究者通過共注射Cas9 mRNA、不同的sgRNA和不同大小的DNA載體進(jìn)入小鼠受精卵，構(gòu)建突變小鼠。通過one-step技術(shù)構(gòu)建出在Nanog，Sox2、Oct4、Mecp2等基因上有熒光信號因子的突變小鼠模型。另外，用sgRNA靶標(biāo)兩個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)在Mecp2基因上，使小鼠約700bp堿基缺失。從而在改造基因的小鼠和胚胎干細(xì)胞中分析5種sgRNA脫靶的可能性，并在罕見的例子中識別出脫靶突變體。采用CRISPR/Cas類型II 系統(tǒng)成功生產(chǎn)出了含有5 個(gè)基因突變的小鼠7。在這項(xiàng)研究中，證明了CRISPR/Cas技術(shù)可以有效應(yīng)用one-step在精確的基因底座上插入稍短的抗原決定部位或者是稍長的熒光標(biāo)記，使的小鼠內(nèi)生基因上帶有因子更加容易。在有些細(xì)胞中脫靶突變體的比例較多，有些細(xì)胞中則較少。總之，CRISPR

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