下述5大類技術(shù)方法各有特色和適用范圍，將可能會(huì)成為在分子診斷各細(xì)分領(lǐng)域的主要檢測(cè)方法。

　　隨著我國常態(tài)化新冠疫情防控措施的落實(shí)落細(xì)，檢測(cè)成本較低、操作簡單、易推廣、準(zhǔn)確度和靈敏度較高，且能滿足短時(shí)間高通量檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在眾多檢測(cè)方法中被認(rèn)可成為新冠檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是隨著檢測(cè)標(biāo)本量的增加，熒光定量PCR法本身的一些缺點(diǎn)曝露的更加明顯。

　　●不夠快：從核酸提取、試劑配制到PCR檢測(cè)的操作和銜接過程需要大量精細(xì)操作，完成一輪檢測(cè)至少需要2小時(shí)，不利于迅速得到檢測(cè)結(jié)果；

　　●檢測(cè)結(jié)果干擾因素多：如樣本種類、樣本采集方法、樣本儲(chǔ)存運(yùn)送、干擾物質(zhì)、拭子類型、保存液類型、核酸提取試劑和熒光定量PCR儀穩(wěn)定性都會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

　　為改善上述問題，研究者嘗試?yán)枚喾N新的擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，如數(shù)字PCR、電化學(xué)PCR、恒溫?cái)U(kuò)增、CRISPR、微流控等技術(shù)方法來解決上述方法之不足。

　　數(shù)字PCR (digital PCR，dPCR) 不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因，在數(shù)萬個(gè)反應(yīng)單元中獨(dú)立檢測(cè)目的序列，顯著降低每個(gè)反應(yīng)單元中背kaiyun中國網(wǎng)頁版登錄景基因和干擾物質(zhì)的豐度，大大提高了檢測(cè)靈敏度和對(duì)特定擴(kuò)增抑制劑的耐受性。

　　目前主要用于稀有突變位點(diǎn)檢測(cè)、拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)、NGS文庫精確定量等。 dPCR在新冠的環(huán)境樣本和臨界濃度新冠樣本檢測(cè)發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)。 ? Suo, T等分別對(duì)14例新冠疑似患者和63例確診患者的臨床樣本進(jìn)行dPCR和熒光定量PCR的盲樣檢測(cè)，對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有26例確診患者的熒光定量PCR檢測(cè)陰性的樣本，用dPCR隨訪檢測(cè)為陽性。該文作者認(rèn)為dPCR可以作為恢復(fù)期患者新冠樣本檢測(cè)結(jié)果再確認(rèn)的補(bǔ)充手段。 現(xiàn)有的dPCR根據(jù)液體分散方式分類：微流控芯片式、自吸分液式和微滴式，其中微流控芯片是將芯片表面光刻多個(gè)腔室，通過閥門控制液體流動(dòng)和分液；自吸分液式是將芯片表面進(jìn)行疏水處理，微孔為親水處理，這種親疏水的方式可以將反應(yīng)體系自動(dòng)的分割為多個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系。微滴式是將反應(yīng)體系通過油包水技術(shù)乳化分散在大小均一的液滴反應(yīng)單元中，相比以上兩種dPCR技術(shù)，微滴式dPCR儀成本更低。 已經(jīng)商業(yè)化的微流控芯片式dPCR儀主要有ThermoFisher公司Quant Studio、Fluidigm公司BioMark和Forulatrix公司Constellation系統(tǒng)。微滴式dPCR儀主要有Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列，銳訊生物公司DropX-2000、小海龜BioDigital以及法國Stilla Technologies公司Naica System。

　　電化學(xué)PCR是將PCR擴(kuò)增和電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)，并集成在一起，旨在提供一種快速、小型化、手持式儀器。電化學(xué)PCR中使用的電化學(xué)活性標(biāo)簽（如金屬配合物、有機(jī)分子等）比熒光染料更耐用和更便宜，同時(shí)電化學(xué)法檢測(cè)所需要的成本也遠(yuǎn)低于光學(xué)器件。 國外已經(jīng)有一些公司利用電化學(xué)PCR技術(shù)開發(fā)出相應(yīng)的微流控產(chǎn)品。其中Atlas Genetics io系統(tǒng)檢測(cè)模塊就是采用電化學(xué)檢測(cè)方法，其電化學(xué)檢測(cè)的原理為：用不對(duì)稱PCR產(chǎn)生單鏈DNA，然后單鏈PCR產(chǎn)物與具有二茂鐵標(biāo)簽的探針結(jié)合成雙鏈DNA。核酸外切酶消化雙鏈DNA產(chǎn)物，探針上的二茂鐵會(huì)在水解過程釋放出來，從而導(dǎo)致溶液中電化學(xué)性質(zhì)改變，這種改變被電化學(xué)傳感器檢測(cè)到并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的改變，從而到達(dá)檢測(cè)的目的。 另外，GenMark公司的ePlex采用了類似于Atlas Genetics io產(chǎn)品的電化學(xué)檢測(cè)來取代常規(guī)的熒光檢測(cè)。與Atlas Genetics io不同的是，非對(duì)稱擴(kuò)增產(chǎn)生大量單鏈DNA后，單鏈DNA跟兩個(gè)探針結(jié)合。一條探針被固定在電極上，一條探針被電化學(xué)標(biāo)記物標(biāo)記。單鏈DNA先一端與固定探針結(jié)合，再另一端與標(biāo)記的探針結(jié)合，因?yàn)闃?biāo)記探針靠近了電極，從而檢測(cè)到了電信號(hào)改變。 FDA最近也批準(zhǔn)了運(yùn)行在ePlex平臺(tái)的GenMark ePlex? SARS-CoV-2檢測(cè)試劑盒。

　　恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (isothermal amplification technology，IAT) 是一種在恒定溫度條件下、較短時(shí)間內(nèi)和特定酶作用下即可完成核酸擴(kuò)增的技術(shù)。與PCR方法相比，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種快速、特殊、更簡單、更便宜的kaiyun中國網(wǎng)頁版登錄樣品核酸檢測(cè)方法。 (了解詳情， 請(qǐng)點(diǎn)擊“閱讀原文” )

　　CRISPR/Cas系統(tǒng)是由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)基因 （Clustered regularly interspaced short palindromic Repeats, CRISPR) 序列與Cas核酸酶構(gòu)成，是基因組編輯的基礎(chǔ)，該技術(shù)在分子診斷檢測(cè)也越來越熱門。由于其高特異性，這種方法在床旁診斷中具有較大吸引力。Hou等人開發(fā)了一種名為CRISPR-covid的快速檢測(cè)SARS-CoV-2，實(shí)驗(yàn)周期更短(~40min)，并同步與RT-PCR和宏基因組測(cè)序進(jìn)行對(duì)比。 （了解CRISPR/Cas檢測(cè)系統(tǒng)可進(jìn)入專題，閱覽原文及文章《CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)在病原診斷中的應(yīng)用》）

　　微流控芯片技術(shù)將核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)集成于一起，因而可擺脫專業(yè)繁瑣的操作以及對(duì)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的依賴，從而可以由非專業(yè)人員完成操作，普及到醫(yī)院門急診、床旁檢測(cè)，甚至可以居家自測(cè)，受眾更加廣泛，臨床適應(yīng)性更強(qiáng)。此外，由于反應(yīng)過程處于封閉的環(huán)境中，可以消除交叉污染的可能性，同時(shí)也避免操作者感染的風(fēng)險(xiǎn)。由于功能集成，提高了檢測(cè)效率，因此可以在較短時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，顯著提升檢測(cè)效率。 現(xiàn)在主要的商業(yè)化微流控分子診斷產(chǎn)品包括GeneXpert全自動(dòng)分子診斷平臺(tái)，F(xiàn)ilmArray全自動(dòng)分子診斷平臺(tái)，Atlas Genetics io系統(tǒng)，ePlex檢測(cè)系統(tǒng)，Cobas Liat PCR 檢測(cè)系統(tǒng)，Revogene全自動(dòng)化分子診斷設(shè)備以及國內(nèi)博暉創(chuàng)新的GenPlex微流控全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)等。 (了解各系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)， 請(qǐng)點(diǎn)擊“閱讀原文” )

　　上述5大類技術(shù)方法各有特色和適用范圍，將可能會(huì)成為在分子診斷各細(xì)分領(lǐng)域的主要檢測(cè)方法。

　　原文以《核酸擴(kuò)增和檢測(cè)新技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用》為題發(fā)表在《臨床實(shí)驗(yàn)室》雜志2022年3月刊專題“POCT分子診斷”新技術(shù)與新方法版塊