三維基因組結(jié)構(gòu)與表觀遺傳修飾是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制，其動(dòng)態(tài)變化與發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定及癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。測(cè)序技術(shù)與固定細(xì)胞熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）等方法極大推動(dòng)了三維基因組互作的研究，但這些方法多依賴固定樣本，難以反映染色質(zhì)在活細(xì)胞中的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。實(shí)現(xiàn)基因組在活細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空可視化是理解基因調(diào)控動(dòng)態(tài)的關(guān)鍵?，F(xiàn)有基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的活細(xì)胞成像技術(shù)雖能靶向內(nèi)源基因序列，但在非重復(fù)序列標(biāo)記、多位點(diǎn)同時(shí)成像及原代細(xì)胞應(yīng)用方面仍存在靈敏度不足、系統(tǒng)復(fù)雜度高等難點(diǎn)。

　　研究團(tuán)隊(duì)在此前CRISPR LiveFISH技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)性升級(jí)，首次在CRISPR系統(tǒng)的引導(dǎo)RNA（sgRNA）標(biāo)記中引入拓展遺傳字母表中的正交非天然堿基對(duì)（unnatural base pairs, UBPs），結(jié)合Cas9/sgRNA結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的理性設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了位點(diǎn)特異性的sgRNA熒光標(biāo)記，顯著提升了染色質(zhì)活細(xì)胞成像的靈敏度和信噪比。PRO-LiveFISH可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多達(dá)6個(gè)基因位點(diǎn)的多色動(dòng)態(tài)觀測(cè)，在無需信號(hào)放大的情況下，僅使用約10條sgRNA可有效標(biāo)記非重復(fù)基因位點(diǎn)，適用于包括原代細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型。

　　利用PRO-LiveFISH技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)多基因位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)觀測(cè)，系統(tǒng)探索了表觀修飾和染色質(zhì)互作相關(guān)的動(dòng)態(tài)調(diào)控規(guī)律。首先，通過比較不同細(xì)胞狀態(tài)、不同細(xì)胞類型中同一基因位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)行為，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與其表觀修飾水平密切相關(guān)：活躍的組蛋白修飾（如乙酰化）常伴隨著受限的位點(diǎn)運(yùn)動(dòng)，而乙?；较陆祫t伴隨更高的位點(diǎn)動(dòng)態(tài)。通過對(duì)特定增強(qiáng)子及其靶基因進(jìn)行同步動(dòng)態(tài)標(biāo)記，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)趧?dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)中依然能保持持續(xù)的空間鄰近，說明這一基因位點(diǎn)的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子（E-P）互作在時(shí)空維度上具有相對(duì)穩(wěn)定性。最后，通過對(duì)超級(jí)增強(qiáng)子及其靶基因的追蹤，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4在維持此類三維互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)BRD4活性受到抑制時(shí)，超級(jí)增強(qiáng)子及其靶基因的空間距離顯著增加，表明了相應(yīng)的三維互作的解離。這些發(fā)現(xiàn)從動(dòng)態(tài)視角闡釋了轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4對(duì)三維基因組的調(diào)控機(jī)制。

　　綜上， CRISPR PRO-LiveFISH通過結(jié)合拓展遺傳字母技術(shù)與sgRNA理性設(shè)計(jì)，為動(dòng)態(tài)三維基因組研究提供了靈活高效的活細(xì)胞多色成像平臺(tái)。該技術(shù)不僅適用于非重復(fù)DNA序列的動(dòng)態(tài)標(biāo)記，也可應(yīng)用于原代細(xì)胞增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作的標(biāo)記。 借助該工具，研究團(tuán)隊(duì)探索了染色質(zhì)動(dòng)態(tài)與表觀遺傳之間的相互關(guān)聯(lián)、解析了增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作的時(shí)空特性，并闡釋了轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4在維持超級(jí)增強(qiáng)子三維互作中的關(guān)鍵作用，從而深化了對(duì)表觀調(diào)控和三維基因組時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制的理解。

　　清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王海峰研究員、頡偉教授以及中科院生物物理所方顯楊研究員是本文的共同通訊作者。清華大學(xué)2019級(jí)博士生劉美鑠、2022級(jí)博士生黃可韻和2020級(jí)博士生張杰（已畢業(yè)）為共同第一作者。西湖大學(xué)于洪濤教授、戚樹濤研究員，清華大學(xué)博士后杜振海（現(xiàn)中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心研究員），以及清華大學(xué)2019級(jí)博士生胡梁?。ㄒ旬厴I(yè)）、2021級(jí)博士生李青陽、2022級(jí)博士生王新銘、2021級(jí)博士生顧卜銘、2023級(jí)博士生唐昊、2021級(jí)博士生馬宇等對(duì)研究做出重要貢獻(xiàn)。研究工作得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、北京市自然科學(xué)基金、清華—北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、疑難重癥及罕見病全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題、清華大學(xué)自主科研計(jì)劃、本源公益基金、新基石科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持。kaiyun開云kaiyun開云